全血处理流式抗体标记问题
问:请教一下各位老师,我看很多protocol包括一些公司的流式细胞抗体说明书都说直接在100ul的全血中加入相应抗体进行标记,这个是为了操作方便减少细胞损伤?还是同时涉及全血中的一些蛋白可以起到封闭非特异性位点的作用?
因为我们留取相关的标本希望能充分利用,一般是全血来了后直接离心分离血清和下面的血细胞,把下面的血细胞加一倍体积的PBS稀释后标记抗体再裂红处理,这样是否会影响*后的流式细胞结果?另外这样裂红操作是否会有影响?因为感觉裂红效果不是非常理想。
答:全血直接加并不是其中的蛋白起到封闭作用,而是为了避免一些稀有细胞的丢失。另一个方便之处就是处理速度快。
你们分离血清后再用下面的血细胞进行处理,此时的红细胞密度会非常高,所以用普通量的红细胞裂解液肯定很难裂干净,此时,建议你分两次裂红,2ml 5分钟->离心->再用2ml 5分钟,这样效果会好一些。如果还不行,就将后一个5分钟延长至10 分钟。
红细胞裂解不干净不会影响结果,但对于calibur这类通量低的机器,会影响*终获取的有效信号数量。所以尽量将红细胞裂解干净 。
问:我们之前确实是裂红一次效果不是很彻底,您看对于100ul的全血标本用1×的裂红液2ml,我们一般是使用50ul体积,是不是裂红液减少到1ml?
答:如果象你前面说的,这个50ul标本是离心去过血清的,并且未经PBS没有稀释,那么红细胞裂解液还是不能减量,因为红细胞数量多。