细胞培养对替代 胎牛血清 的适应许多细胞*易于采用连续适用法。将含有FBS的通用培养基和含有替代 胎牛血清 的培养基按1：1(体积比)混合，用混合后的培养基来培
养细胞。每次成功传代后，按下列比例减少通用培养基的用量：
1：2、1：4、1：16、和100%含替代胎牛血清培养基。对于每次胎牛血清的成分变化，都要将细胞传代培养2-3次以进行适应。细胞可能可以适应直接从FBS到替代胎牛血清的转换。起初要使用和FBS浓度相同的替代胎牛血清。细胞生长可能会发生延迟。可以传代2-3次，使细胞生长速率恢复到以前的水平。细胞从单层生长到悬浮培养适应贴壁细胞对悬浮培养的适应可能需要提高细胞密度或使用无胎牛血清培养基培养的细胞。本方案说明了使用T-25或T-75培养瓶培养的细胞适应时所需要的步骤。大约需要6-8个 T-75培养瓶才可以提供一个转瓶或摇瓶所需的Hela细胞量(5X107)。
注意：对于不同的细胞系，*初培养瓶的细胞数量各不相同。为了得到*佳结果，请遵从下列事项：
?使用50-80%汇合的细胞；
?使用存活率大于90%的细胞。
1．去除生长培养基。
2．用不含钙镁的1X D-PBS冲洗细胞(T-25培养瓶中加3ml,T-75培养瓶中加5ml)。丢弃冲洗用的溶液。
3．将胰酶-EDTA(0.05%胰酶，0.53mM EDTA?4Na; T-25培养瓶中加3ml，T-75培养瓶中加5ml)加到培养瓶中与细胞相对的一侧。摇动培养瓶几次。丢弃所有溶液，只保留能够形成一薄层液膜覆盖住细胞的胰酶-EDTA即可。在37℃下孵育细胞5-10分钟。孵育期间用显微镜观测细胞。当细胞都变圆后，轻敲培养瓶以使细胞离开瓶壁。
4．加入生长培养基(T-25培养瓶中加6ml,T-75培养瓶中加10ml)使细胞悬浮。
注意：如果使用无胎牛血清培养基，应加入大豆胰酶抑制剂。通常使
0.25mg/ml的胰酶抑制剂，按1：1(体积比)的比例加入即可抑制胰酶。
5．将细胞悬液转移到一个15ml离心管中。用100Xg的速度离心4分钟。吸去上清液(胰酶-EDTA与生长培养基的混合物)。
6．用5ml生长培养基重悬细胞。用100Xg的速度离心4分钟。 去上清液。
注意：如果使用无胎牛血清培养基，应用不含钙镁的D-PBS重悬细胞。
7．用5ml生长培养基重悬细胞。计算活细胞的个数。
8．用生长培养基将细胞密度稀释到5X105cells/ml。
9．在无菌转瓶或摇瓶中进行传代培养。瓶上部要留出足够的空间以进**体交换(250ml转瓶可加入100ml培养基，250ml摇瓶可加入75-100ml培养基)。注意：对于不含剪切力保护剂的无胎牛血清培养基，请加Pluronic. F68，直到*终浓度为0.1%。
10．拧松瓶盖以进**体交换，然后将培养瓶放入含有5-10%CO2的37℃潮湿环境中。对于转瓶，将叶轮转速设定
为75-95rpm。对于摇瓶，将摇床转速设定为125-135rpm。
11. 每天检测存活细胞的密度，建立悬浮培养的生长动力学曲线。
12．当细胞密度达到1X106cells/ml时(或在接种后的第四天)，以
5X106cells/ml的密度传代细胞。注意：如果接种后的第四天，细胞密度没有达到1X106cells/ml，则必须在离心后添加新鲜生长培养基。
13．三次传代后，如果细胞密度可以在接种后第三天达到1X106细胞/ml，并且存活率大于90%。则可以认为cells适应了悬浮培养。此时，接种密度可降至2 X105到3X105cells/ml。哺乳动物细胞的深低温保藏
哺乳动物细胞的深低温保藏可以避免因污染造成的损失，尽量减少连续细胞系的遗传改变，并避免有限细胞系的衰老和转化。在深低温保藏之前，要对细胞进行鉴定并检查其是否遭受污染。
下面列出了几种可用于冻存细胞的常用培养基。对于含胎牛血清培养基，
常用的培养基包括：
*.含有10%甘油的完全培养基。
*.含有10%二甲基亚砜(DMSO)的完全培养基。
*.50%细胞条件培养基与50%含有10%甘油的新鲜培养基的 混合培养基。
*.50%细胞条件培养基与50%含有10%DMSO的新鲜培养基的混合培养基，对于无胎牛血清培养基，常用的培养基包括：
*.50%无胎牛血清细胞条件培养基与50%含有7.5%DMSO的新鲜无胎牛血清培养基的混合培养基。
*.含有7.5%DMSO和10%细胞培养级BSA的新鲜无胎牛血清培养基。悬浮培养细胞
1．计算要进行深低温保藏的活细胞个数。细胞应处于对数期。用200-400Xg 的速度将细胞离心5分钟以沉淀收集细胞。用移 液管吸除上清液，尽量吸净，勿扰动细胞。
2．对于含胎牛血清培养基，以1X107-5 X107cells/ml的浓度将细胞重悬于冻存培养基中；对于无胎牛血清培养；重悬浓度应为0.5×107-1×107cells/ml。
3．等量分装于冻存管中。将冻存管置于冰水混合物中，或者保存在4℃ 的冰箱中，并在5分钟内开始进行下面的冻存步骤。
4．以1℃/min 的速率缓慢冷冻细胞。即可使用调节的冷冻机进行冻存，也可以将冻存管放入绝缘盒，然后放入-70℃--90℃的冰箱中，*后转入液氮保存。贴壁培养细胞
1．使用解离剂使细胞脱离器皿壁。解离时要尽量轻柔，以免损伤细胞。
2．用完全生长培养基重悬解离下来的细胞，并计算活细胞的个数。
3．用大约200Xg的速度离心5分钟以沉淀收集细胞。用移液管吸附上清液，应尽量吸净，勿扰动细胞。
4．将浓度为5X106-1 X107cells/ml的细胞重悬于冻存培养基中。
5．等量分装到冻存管中。将冻存管置于冰水混合物中，或者保存在4℃ 的冰箱中，并在5分钟内开始进行下面的冻存步骤。
6．以1℃/min 的速率缓慢冷冻细胞。即可使用调节的冷冻机进行冻存，也可以将冻存管放入绝缘盒，然后放入-70℃--90℃的冰箱中，*后转入液氮保存。
