原理和程序
MethylFlash™ 羟甲基化 DNA 定量试剂盒（比色法）包含了对整体 DNA 羟甲基化进行比色定量所需的所有试剂。在该检测中，DNA 结合到剥离经过专门处理的孔中，这些孔具有高 DNA 亲和力。使用捕获和检测抗体检测 DNA 的羟甲基化部分，然后通过在微孔板分光光度计中读取 450 nm 处的吸光度，通过类似 ELISA 的反应进行定量。羟甲基化 DNA 的量与测得的 OD 强度成正比，这可以通过试剂盒中包含的两种不同 DNA 样品的相对羟甲基化状态公式或使用标准曲线对 5-羟甲基胞嘧啶 （5-hmC） 的绝/对定量进行计算。

简单、快速、灵活
整个比色测定具有易于遵循的步骤，方便快捷，可在 3 小时 45 分钟内完成。条孔微孔板规格允许在手动或高通量分析中进行灵活的分析。试剂盒包含通用阳性和阴性对照，用于定量来自任何物种（如哺乳动物、植物、真菌、细菌和病毒）的羟甲基化 DNA。

安/全方便
定量整体 DNA 羟甲基化所需的所有试剂，包括阴性对照和阳性对照，都方便地包装在试剂盒中。DNA 样品的直接比色定量取代了过时或劣质的方法，无需 DNA 消化/变性、放射性、提取或色谱分析。

高灵敏度和特异性
新颖的程序和专有的试剂盒组成能够以高灵敏度和特异性实现羟甲基化 DNA 的准确定量。起始 DNA 的检测限可低至 40 pg 的羟甲基化 DNA，动态范围为 40 pg 至 20 ng（见图 2）。分析灵敏度比 HPLC 高约 10 倍（0.008% 对 0.08%）。与甲基胞嘧啶和未甲基化的胞嘧啶没有交叉反应性，因此仅检测到羟甲基化 DNA （5-hmC）（见图 3）。

反应灵敏、可靠且实用
基于其工作原理和微孔板形式，该试剂盒可实际和常规地用于各种形式的任何物种，包括培养细胞、新鲜和冷冻组织、石蜡包埋组织、血浆/血清样品和体液样品。为了证明该试剂盒的功能，它已成功用于定量小鼠大脑和 HeLa 细胞 DNA 中 5-hmC 的含量。MethylFlash™ 试剂盒测得的 5-hmC 百分比与 HPLC 和 LC-MS 方法检测的百分比平行且相当（参见表 1）。通过使用该试剂盒，首/次在正常人脑和结肠组织中发现了高丰度的 5-hmC。此外，它表明 5-hmC 分别占正常人脑和结肠组织中总甲基化胞嘧啶（5-mC 加 5-hmC）的 32% 和 16%（见表 2）。相比之下，结肠癌细胞系 （HCT116） 和宫颈癌细胞系 （HeLa） 中的 5-hmC 较低或不存在（参见图 4A 和 4B）。

图 2.证明 MethylFlash™ 试剂盒实现了 5-羟甲基胞嘧啶检测的高灵敏度。将合成的羟甲基化 DNA 以不同浓度加入检测孔中，然后用 MethylFlash™ 羟甲基化 DNA 定量试剂盒进行测量。

图 3.证明 MethylFlash™ 试剂盒实现了 5-羟甲基胞嘧啶检测的高特异性。将合成的未甲基化 DNA（仅包含胞嘧啶）、甲基化 DNA（仅包含 5-甲基胞嘧啶）和羟甲基化 DNA 标准品（仅包含 5-羟甲基胞嘧啶）以不同浓度加入检测孔中，然后用 MethylFlash™ 羟甲基化 DNA 定量试剂盒进行测量。

图 4.证明人脑和结肠组织中 5-羟甲基胞嘧啶丰度高。将 200 ng 从不同组织或细胞中分离的 DNA 加入检测孔中，并使用 MethylFlash™ 羟甲基化 DNA 定量试剂盒测量 DNA 的羟甲基化部分。A： 在各种 DNA 样品中测量的 OD 强度。B：各种组织和细胞中羟甲基化 DNA 的百分比。