实验三植物培养基的制作与园林植物培养

一、实验目的 
  熟悉植物培养基的基本成分及其作用，掌握培养基的配制、分装方法及操作要求，掌握培养基与接种用品的灭菌原理及高压蒸汽灭菌锅的使用方法。
  通过月季等园林植物的组培操作，了解植物组织培养的基本原理和一般方法，及其在园林植物育种中的应用。
二、实验原理 
  培养基主要为离体培养植物材料的生长提供营养物质和生长调剂物质，通常分为基本培养基和完全培养基两个水平。前者包括大量元素（无机营养元素）、微量元素、有机附加物（维生素、氨基酸等）、糖和水，固体培养基还需加入凝固剂如琼脂；完全培养基是在基本培养基的基础上，根据不同的试验材料和目的，添加一定浓度的生长调节剂如 BA 、 NAA 等以及成分复杂的有机附加物如椰子汁、水解酪蛋白等。另外，培养基还应具有适宜的 pH 值。不同种植物的离体培养，甚至同种植物不同器官或组织的培养对培养基的要求可能有些不同。园林植物离体培养常用的基本培养基主要有 MS 、 N6 、 B5 、 Nitsch 、 White 、 WPM 等。
  琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用*广的凝固剂。加入琼脂制成的培养基在 98 ～ 100 ℃下融化，于 45 ℃以下凝固。但多次反复融化，其凝固性会降低。
  植物培养基含有丰富而**的营养物质，能供养很多细菌、真菌等微生物的生长。因此，任何一种培养基一经制成便需及时彻底灭菌，以备培养之用；接种时使用的所有用品如滤纸、水等也要进行灭菌。一般采用高压蒸汽灭菌，于高压灭菌锅内进行，在 1.1 kg/cm 2 、 121 ℃的条件下消毒 20 ～ 25min 。
  研究表明，植物的细胞具有全能性，即在一定的培养基（包括营养成分、激素等）和培养条件下可再生出完整的植株。通过合适的激素配比和培养条件可调控植物细胞的分裂和分化，改善植物的分化和繁殖能力。
三、主要仪器及试材 
1 ．仪器用具
  电子天平、称量纸、牛角匙、精密 pH 试纸、量筒、烧杯、胶头滴管、移液管、玻璃棒、培养皿或培养瓶、封口膜、电炉或微波炉、灭菌锅、干燥箱、水浴锅、超净工作台、镊子、手术刀、无菌滤纸、酒精灯、培养箱（室）等。
2 ．药品试剂
  大量元素（ NH 4 NO 3 、 KNO 3 、 MgSO 4 ·7H 2 O 、 KH 2 PO 4 、 CaCl 2 ·2H 2 O ）、微量元素（ KI 、 H 3 BO 3 、 MnSO 4 ·4H 2 O 、 ZnSO 4 ·7H 2 O 、 Na 2 MoO 4 ·2H 2 O 、 CuSO 4 ·5H 2 O 、 CoCl 2 ·6H 2 O ）、有机成分（肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸）、 FeSO 4 ·7H 2 O 、 Na 2 EDTA·2H 2 O 、 琼脂、蔗糖、 0.5M NaOH 、 BA 、 NAA 等。
  培养基（包括大量元素、微量元素、有机成分、植物激素等）、无菌水、脱脂棉、 95 ％酒精、双氧水、蒸馏水等。

四、实验方法与步骤 
  1 ． 培养基母液的配制 —— 以 MS 培养基为例 
  MS 培养基含有近 20 种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这些成分单独进行称量，可将培养基中的各类成分，分别按原用量的 20 倍或 200 倍配成浓缩液，即培养基母液。这样每次使用时，取其总量的 1/20 （ 50 ml ）或 1/200 （ 5 ml ），便可配成培养液（基）。
  1 ）大量元素母液（ 20 ×）：分别称取 33g NH 4 NO 3 、 38g KNO 3 、 7.4g MgSO 4 ·7H 2 O 和 3.4g KH 2 PO 4 ，装入 500ml 烧杯中，加入适量蒸馏水将其充分溶解；另称取 8.8g CaCl 2 ·2H 2 O ，单独溶于 200ml 蒸馏水。然后将二者混合，定容至 1 L ，充分混匀后于 4 ℃条件下贮存备用（下同）。
  2 ）微量元素母液（ 200 ×）：分别称取 4.46g MnSO 4 ·4H 2 O 、 1.72g ZnSO 4 ·7H 2 O 、 1.24g H 3 BO  
  3 、 166mg KI 、 50mg Na 2 MoO 4 ·2H 2 O 、 5mg CuSO 4 ·5H 2 O 、 5mg CoCl 2 ·6H 2 O ，加蒸馏水溶解后，定容至 1L 。
  3 ）有机成分母液（ 200 ×）：分别称取 10g 肌醇、 50mg 烟酸、 50mg 盐酸吡哆醇、 50mg 盐酸硫胺素、 200mg 甘氨酸，加水溶解后，定容至 500ml 。
  4 ）铁盐母液（ 200 ×）：称取 5.56g FeSO 4 ·7H 2 O 和 7.46g Na 2 EDTA·2H 2 O ，分别溶于 450ml 蒸馏水中，加热并不断搅拌使之完全溶解，然后将两种溶液混合，于 80 ℃水浴中充分熬合（ 30min ），*后定容到 1 L ，保存于棕色容量瓶中。
  生长调节剂母液：称取 50mg 或 100mg 植物生长调节剂（如 BA 、 NAA 、 IBA 等）粉末，置于 100ml 容量瓶，生长素类先用少量酒精溶解，细胞分裂素类先用少量 0.5M NaOH 溶解，然后以蒸馏水定容至刻度，即配成 0.5 或 1.0 mg/ml 的母液。
  2 ． 培养基的配制 
  以配制 1 L MS ＋ BA 1.0mg/L ＋ NAA 0.5mg/L 固体培养基为例，基本操作过程如下：
  1 ）称取 30g 蔗糖和 7g 琼脂，装入 1 L 的容器（如烧杯）中，加入约 700ml 蒸馏水，置于带石棉网的电炉上或微波炉中加热，并用玻棒搅拌，至琼脂完全溶化。
  2 ）用量筒或移液管分别取 50ml 大量元素母液、 5ml 微量元素母液、 5ml 有机成分母液和 5ml 铁盐母液，加入上述容器中。
  3 ）分别用 1ml 移液管吸取 1ml BA 母液（ 1.0mg/ml ）和 0.5ml NAA 母液（ 1.0mg/ml ），加入培养基中，然后加蒸馏水将总体积定到 1000ml 。
  4 ）以 0.5M NaOH 溶液将培养基的 pH 调至 5.8 ～ 6.0 ，混匀后分装于培养容器中，每瓶装入约 30ml 培养基，然后用聚乙烯膜封口。如果采用培养皿进行培养，配制好的培养基可先装入三角瓶，灭菌后（培养皿同时灭菌）于超净工作台上进行分装。
  3 ．灭菌 
  将培养基、无菌水、滤纸、器皿等放入高压灭菌锅内，于 1.01kg/cm 2 压力、 121 ℃条件下灭菌 20min 。灭菌完毕后，将培养基取出（其他灭菌材料一并取出），水平放置于实验台上，待其冷却凝固后便可用于接种培养。
  具体操作按灭菌锅的说明书进行，包括加水、装锅、盖盖、加热、排放冷空气、升压保温、降压排气、出锅冷却等步骤。
  彻底灭菌后的培养基可于实验室内保存一段时间，但*好尽快使用。
  4． 接种材料（外植体）的消毒： 将带腋芽的枝条剥去枝条上的叶片，先以自来水冲洗干净，再在超净工作台上以 70% 的酒精和 0.1% 升汞溶液进行表面消毒，无菌水漂洗 3 ～ 5 次。然后在无菌条件下将带芽的枝条切成芽段（每段带有一个腋芽），用于接种。试管苗不需经过消毒可直接将其切成芽段进行接种。
  5 ．接种： 将外植体材料接种到已灭菌的培养基中。
  6 ．培养： 将接种好的材料置于培养箱或培养室内进行培养。培养条件为温度 25 ± 1 ℃，光照强度 1000 ～ 1200 lux ，光照时间 12 h/d 。
  7 ．继代增殖： 将萌发后的嫩芽切下，接种于继代培养基上，调整培养基中附加激素的比例，可获得大量的丛生芽。
  8 ．生根培养 ：将长到一定高度的芽切下，接种到生根培养基中，诱导生根后移植。
  9 ．试管苗的移栽 ：将诱导发根后的月季试管苗从培养瓶中轻轻取出，洗净根部培养基。植株上部只保留 3 ～ 4 片叶，其余的叶剪去，将其细心地移入准备好的小盆中。浸透水后置于塑料棚内。棚内空气湿度保持在 85 ％以上，温度 10 ～ 20 ℃左右。一周后慢慢揭膜练苗，半月后将薄膜全部揭开，并喷施稀薄营养液，使小苗得到营养补充。
五、实验注意事项 
  1 ．配制培养基母液的浓度应根据实际使用情况确定，*好能使母液在 1 ～ 2 个月内用完，其中有机成分要在 4 ℃冰箱内保存。大量元素母液的配制过程中， CaCl 2 必须单独溶解，然后再与其他成分的溶液混合，否则溶液中易出现沉淀；配制铁盐母液时，两种成分应单独溶解后再于 80 ℃左右充分熬合，避免发生结晶沉淀。
  2 ．配制培养基的所用器皿和用具均应洗涤干净，培养基的 pH 值应调整准确，灭菌时间不宜过长，否则培养基可能会出现不凝固现象。
  3 ．培养基配制后应及时进行灭菌，如因特殊情况不能及时灭菌，*好放入冰箱内暂存。
  4 ．高压灭菌锅的使用应严格按照说明书进行操作，尤其注意检查锅内水位，防治干烧导致电热管损坏。
六、实验结果处理 
  １． 5 ～ 6 人为一组，每组按要求配制一种培养基，分装灭菌。
  ２．记录培养基配制与灭菌的一般程序和注意事项。
  3．所有的实验用具均需严格洗净，和培养基一起灭菌后使用。
  4．接种的整个过程都需在无菌条件下进行，不得违章操作。
七、思考题 
  １． MS 培养基的主要成分有哪些？在植物材料的离体培养中各起什么作用？
  ２．如何保证灭菌后培养基能正常凝固？
  3．植物组织培养的原理是什么？
  4．谈谈植物组织培养在园林植物育种中的应用价值。