载体构建|实验技术服务

关键词:载体构建|实验技术服务
简介：世界****载体构建|实验技术服务原装**，质量保证,价格优惠。
载体构建|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
我们具备丰富的蛋白表达设计经验及实验操作技巧，承诺客户不成功不收费。我们所有的实验数据真实可信，我们提供原始的表达菌株和克隆质粒，客户可以依据我们的实验报告重复我们的实验结果。
产品品牌：载体构建|实验技术服务   http://www.shijichina.com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
测序实验流程：
设计siRNA靶序列
在制备siRNA 前都需要单独设计siRNA序列.研究发现对哺乳动物细胞,*有效的siRNAs是21-23个碱基大小、3’端有两个突出碱基的双链RNA；而对非哺乳动物，比较有效的是长片段dsRNA。siRNA的序列专一性要求非常严谨，与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。
1.  选择siRNA靶位点
从转录AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列，记录跟每个AA 3’端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%-50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions,UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果 
2.  序列同源性分析
将潜在的序列和相应的基因组数据库（人或者小鼠、大鼠等等）进行比较,排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）选出合适的目标序列进行合成.并非所有符合条件的siRNA都一样有效,其原因还不清楚，可能是位置效应的结果,因此对于一个目的基因，一般要选择3-5个靶位点来设计siRNA。
3.  设计阴性对照
一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA中的碱基序列打乱。当然，同样要保证它和其他基因没有同源性。
合成模板
1.  合成编码 shRNA的DNA 模板的两条单链，模板链后面接有RNA PolyIII聚合酶转录中止位点，同时两端分别设计 BamH I 和 Hind III 酶切位点，可以克隆到 siRNA 载体多克隆位点的 BamH I 和 Hind III 酶切位点之间。
2.  95℃，5 min，缓慢退火， DNA 单链得到 shRNA 的 DNA 双链模板。