流式细胞术服务|实验技术服务

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流式细胞术服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
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测序实验流程：
PI 染色操作步骤
1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定。
4、离心，弃上清液。
5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。
7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。
9、混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。
GFP PI染色操作步骤
1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。
以下步骤同PI 染色操作步骤的
细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤
1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm，5min，弃上清液。
2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。
3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。
4、离心弃上清液。
5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。
6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。
细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤
1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤
3、 用PBA稀释的**抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1.5-2h。离心，弃上清。
4、 BS1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。
5、 PBA适当稀释的荧光素标记的**抗体200ul。吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min，避光。
6、 PBS 1ml离心洗涤2次。
7、将细胞重新悬浮于500ulPBS中，混匀，置流式管中，避光，4℃冰箱保存，待测。
胞内直接免疫荧光染色操作步骤
1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、用1×PBS1ml洗涤1次，离心。
3、4%PFA 1ml，4℃固定30min。
4、用1×PBS1ml洗涤1次，离心。
5、0、1% Triton-100 1ml, 室温10min。
6、用1×PBS1ml洗涤1次，离心。
7、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul，用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。
8、离心弃上清液。
9、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。
10、向细胞中加入冷PBS500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。
胞内间接免疫荧光染色操作步骤
1-6、同胞内直接免疫荧光染色操作步骤
7、加入用PBA稀释的**抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1、5-2h。离心，弃上清。
8、冷PBS1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。
9、加入PBA适当稀释的荧光素标记的**抗体200ul。吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min，避光。
10、冷PBA1ml离心洗涤2次。
11、将细胞重新悬浮于500ulPBS中，混匀，置流式管中，避光，4℃冰箱保存，待测。