RNAi质粒载体构建|实验技术服务

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RNAi质粒载体构建|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
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测序实验流程：
近年来的研究表明,一些短片断的双链RNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型, 称为RNA干扰（RNA interference,RNAi）.siRNA（small interfering RNAs）就是这种短片断双链RNA分子,能够以序列同源互补的mRNA为靶目标,降解特定的mRNA.RNAi的发现具有划时代的意义,它不仅深入揭示 了细胞内基因沉默的机制,而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具,极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程.现在越来越多的研究人员开始采用RNAi 来研究生物体的基因表达.RNAi技术可广泛应用到包括功能基因组学,药物靶点筛选,细胞信号传导通路分析,疾病治疗等等.
目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括：
·化学合成
·体外转录
·长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)
·siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs
·PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达
获得高纯度的siRNA产物是进行实验的**步,而转染的效率则是非常关键的因素.
RNAi表达载体的构建
1. 目的基因的确定
2、设计siRNA靶序列
在制备siRNA 前都需要单独设计siRNA序列.研究发现对哺乳动物细胞,*有效的siRNAs是21-23个碱基大小、3’端有两个突出碱基的双链RNA；而对非哺乳动物,比较有效的是长片段dsRNA.siRNA的序列专一性要求非常严谨,与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果.
（1）、选择siRNA靶位点：
从转录AUG起始密码子开始,搜寻下游AA序列,记录跟每个AA 3’端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点.有研究结果显示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效. Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions,UTRs),原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域,而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结 合mRNA从而影响siRNA的效果.
（2）、序列同源性分析:
将潜在的序列和相应的基因组数据库（人,或者小鼠,大鼠等等）进行比较,排除那些和其他编码序列/EST同源的序列.例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）选出合适的目标序列进行合成.并非所有符合条件的siRNA都一样有效,其原因还不清楚,可能是位置效应的结果,因此对于一个目的基因,一般要选择3-5个靶位点来设计siRNA.