MTT检测技术服务|实验技术服务

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MTT检测技术服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
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测序实验流程：
MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，在活细胞中作用于线粒体的呼吸链，MTT在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量与活细胞数目成正比，生成的formazan结晶可溶解在DMSO中，利用酶标仪测定570 nm处的光密度OD值，可以反映出活细胞数目和细胞活力。死细胞中由于没有琥珀酸脱氢酶，因此不能还原MTT生成formazan结晶。
优点：经济、灵敏度高，可用于大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
缺点：由于MTT经还原所产生的formazan结晶产物不溶于水，需有机溶剂溶解后才能检测，这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且有机溶剂对实验人员也有损害。
①将对数生长期的细胞浓度调整为1~10×104细胞/ml，按103~104个细胞接种于96孔板，每孔100 μl；
②培养细胞24小时后，对其进行不同处理，每个处理设三个平行对照；
③（MTT法）适当培养时间后，取出细胞，倒掉培养液，每孔加入5 mg/ml新鲜配制的MTT溶液，温育4小时，再次倒掉上清液，每孔加入200 ml DMSO，摇匀后，酶标仪检测吸光值。
③（台盼蓝拒染法）适当培养时间后，收集细胞，经台盼蓝染色，在倒置显微镜下计数蓝染及不染色细胞，计算细胞存活率。
操作步骤：
1、无菌条件下取新生**的SD大鼠DRG。
2、镜下去除神经根和外膜，接种于预先涂有L-多聚赖氨酸的96孔培养板中，每孔1个DRG。
3、待DRG贴壁后加入100μl无血清L15基础培养基，实验组加入纯化的表达蛋白（分别以不同的蛋白浓度），阴性对照加入等体积的溶解表达蛋白的溶剂。
4、37℃ 5%CO2培养，每天在Olympus倒置显微镜下观察细胞的生长情况，并进行测量，其数据作统计分析。
注意事项
1、选择适当得细胞接种浓度。
2、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，*后比色以空白调零。
MTT实验吸光度*后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系,IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度.