cDNA文库构建/EST测序分析技术服务|实验技术服务

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测序实验流程：
利用PCR技术,只需增加一步逆转录反应,便可从少数mRNA的构建cDNA文库,以mRNA为模板,以oligo(dT)为引物,在依赖于RNA 的DNA聚合酶催化下体外合成cDNA**链之后,可通过PCR扩增此链.
如在此链的3'端再加上一段鸟苷酸残基同聚物,则可以使用oligo(dT)和oligo(dC)作为后续PCR扩增的引物,也可酌情在这些引物的5'端加上限制性酶切点,以利于将所得的双链DNA克隆到适当的载体中.
在某些情况下,如已知RNA(或其基因)两端的核苷酸序列,mRNA5'端核苷酸序列或其编码的蛋白质N端的氨基酸序列,便可设计特定的两端引物,用于直接克隆特定的目的基因cDNA,从而省略从cDNA文库中筛选cDNA克隆等序列费时的操作.
优 点:适于研究mRNA,活力强,价格低廉等.
缺 点:不同制品的活性差别较大,且合成分子量较大(71X105 Dal)的蛋白质时往往提前终止.
TRIzol Reagent 提取total RNA(GIBCO)
1. 查表2根据样品量选择适当的 TRIzol Reagent体积装入50ml RNase-free离心管中，注意样品体积不能超过TRIzol Reagent体积的10%。
2. 将组织样品放入TRIzol Reagent中，高速下匀浆15-30秒/次，直至看不见组织和细胞碎片。
3.室温温育10分钟 。
4. 据表2加入适量体积的氯仿，剧烈震荡15秒钟，然后室温下温育3分钟。
5. 4ºC，12000g离心15分钟，形成淡红色的苯酚/氯仿有机相，中间相和上层水相，水相约占TRIzol体积的60%。
6. 转移上清于另一个Rnase-free的 50ml离心管中。根据表2加入适量异丙醇，-20ºC沉淀1小时以上。
7. 4ºC,12000g离心10分钟。
8. 去上清，据表2加入适量体积的75%的乙醇混匀。
9. 4ºC，7500g离心5分钟。
10. 去上清，空气中干燥或真空抽干RNA沉淀，但不要太干。加入适量体积的DEPC-WATER,溶解沉淀。
11. 取少量RNA用于测定其OD值和电泳，其余置-80ºC冰箱中保存。
1 核酸杂交
是*常用,*可靠的方法之一.可大规模地分析文库的克隆子.
1)同源探针:至少含有所需cDNA克隆的一部分确切序列.常用于以一个部分克隆分离cDNA文库中的全长克隆.
2)部分同源探针:探针的序列与所要筛选的cDNA克隆的序列相关但不相同.常用于克隆家族基因.
3)总cDNA探针:
通过反转录酶均匀掺入放射性核苷酸或通过总的或分级分离得到的poly(A)+mRNA进行末端标记而获得cDNA探针.
cDNA扣除探针:
从**种mRNA制备cDNA探 针, 连续多次与20倍过量的**种mRNA杂交;
回收未杂交的cDNA探针, 再与100倍过量的**种mRNA杂交, 使得原mRNA中的一些特异序列得到高度富集.
* 主要用于探测cDNA文库中与调节水平有所差别的mRNA克隆.
5)合成寡核苷酸探针
2 特异性免疫学检测
在cDNA表达文库中,目的基因的表达产 物能与特异性抗体发生免疫学反应,通过酶学的方法加以检测
3 cDNA克隆的同胞检测
将cDNA文库分成若干组含有10-100个克隆子的易于处理的亚cDNA文库,对每组亚cDNA文库进行检测,当鉴定出阳性库后再不断将其分成更细的库进行检测,直到获得阳性单克隆.
4 cDNA克隆的确证
cDNA克隆含有编码某一特定蛋白质的完整氨基酸序列的开放读框.
第四节 目的基因的分离
外源基因:
插入到载体内的那个特定的片段基因.
目的基因:
那些已被或者准备要分离,改造,扩增或表达的特定基因或DNA段.